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制成免疫荧光容易出现的问题和注意事项

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在制作原代细胞免疫荧光时,容易出现一些问题,造成荧光鉴定失败,将抗原或抗体标记上荧光素,制成荧光抗体检测组织或细胞内的相应抗原(或抗体)时,一定要注意抗体的比例高低和浓度。

制作免疫荧光常用的方法有:

方法一:直接法

步骤:将荧光标记的特异性抗体(抗原)直接加在抗原(抗体)上,经一定的温度和时间染色,水洗—干燥—封片—镜检

优点:操作简便、特异性高、非特异性染色少

缺点:敏感性低

方法二:间接法

步骤:先用已知未标记的特异性抗体(一抗)与抗原反应,再用标记的抗体(二抗)与其反应,形成抗原—抗体—抗体复合物,水洗—干燥—封片—镜检

优点:敏感性强,目前多采用间接法

缺点:操作复杂

实验过程中常见的问题:

1,整个细胞片都出现荧光高点

原因有二:一是二抗浓度过高,适当降低二抗浓度即可。二是二抗发生沉淀,可以使用过滤或者离心荧光标记二抗

2,信号弱或无信号,染色细胞过少

目标蛋白在细胞中没有表达,需要制备细胞裂解液,用Western   Blotting验证目标蛋白在细胞中是否表达

表达目标蛋白的细胞过少标本中使用更多的细胞,试用其他瞬时转染方法,或者使用稳定转染细胞系

细胞通透性差需要增加通透剂作用的时间或者浓度,或改用其它的通透剂

染色前的固定步骤破坏了抗原表位,改用其他固定方法。

通透使抗原丢失,可以减少通透剂作用的时间或强度。

抗体不识别,需要换用其他抗体

一抗稀释度过大使用同一样品按zui佳的二抗用量作一抗稀释曲线,以确定zui佳的一抗稀释比例。

二抗选择错误要使用正确的二抗

3,镜下观察只有DAPI的蓝光,目的荧光几乎没有或者很弱

出现这种现象很有可能是抗体比例太低,需提高抗体浓度,可配合提高二抗浓度;共聚焦的激发荧光强度不够大;二抗孵育时是否是对应的种属,比如本来需要山羊抗鼠结果加为山羊抗兔

4,细胞核周围总是存在有一些蓝色的小点点

这种情况一般是支原体污染所致,建议用杀支原体药2周后再检测,或者通过提高共聚焦机器背景值来覆盖支原体荧光

 

 

5,如何共定位的视野

共定位时,首先判断哪些细胞是转染成功的,比如我过表达了蛋白A,想做蛋白A和蛋白B的共定位关系,则在视野中寻找已成功转染蛋白A的细胞,一般荧光强度会显著高于周边其他细胞,再在这个细胞上观察蛋白B的表达。

6,视野中细胞与细胞之间存在散在的发光点

有两种情况可造成:1,拍照时PBS量过少引起的非特异性;2,PBS未过滤,未溶解的残渣黏附而导致

三、除此之外,这些注意事项也要牢记

1、合适的抗体稀释比例

通过优化抗体稀释比例来优化染色,通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下,可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是*次使用该抗体或测定某抗原,强烈建议浓度梯度实验。

2、抗体特异性

免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体,可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下,纯化抗体的效果很好,但是正确的对照可以帮助定位抗原。使用只有二抗染色的片子

3、细胞固定和通透

为达到zui佳的检测效果,细胞需要经过固定和通透。这些步骤非常关键,细胞和抗原需要保证zui佳的结构,并利于抗体与抗原结合。通常情况下,需要通过以下步骤得以实现:细胞用2%-4%多聚甲醛固定,之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。前者是比较温柔的处理,但是对于核内抗原可能无效,需要用到Triton。使用皂角苷进行通透时,要注意它会引起细胞膜的可逆性通透,也就是除了在通透初期,在每个抗体孵育环节都需要进行通透。另外,细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透,可以避免去垢剂的使用。

4、封闭条件的优化选择

为了防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前用封闭液封闭,这样可以减少非特异性的背景着色。封闭液可以选择二抗来源一致的血清,一般来说,血清价格比较昂贵,可以用1%-5%BSA替代,BSA可以说是的封闭血清。另外封闭时间不易过长,30-60min即可,且封闭后不用洗涤,直接加一抗孵育即可。

5、一抗二抗的选择

封闭过后需要一抗孵育,可以选择4度过夜孵育或者室温3h,以笔者的经验是一抗孵育4度过夜比较好,抗原抗体结合会比较充分。一抗二抗的稀释比例可以根据抗体说明书来,再根据自己具体的实验要求进行优化。如果抗体浓度过低,会造成信号太弱,如果抗体浓度过高可能会造成背景染色太强。荧光二抗个人感觉Alex flour荧光基团信号强于Dylight强于FITC。如果做免疫双标,一抗要来自不同种属,荧光二抗的光谱也要分开。

 

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