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小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法

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海马体主要负责记忆和学习,日常生活中的短期记忆都储存在海马体中。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元具有长突起,由细胞体和细胞突起构成。

       小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织,因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性,具有不能传代,不能增殖等特点,所有收到细胞后尽快使用。

       1.试验所需仪器设备及试剂

       (1)仪器

        生物安全柜

        CO2细胞培养箱

        荧光倒置显微镜

        高速冷冻离心机

        电热恒温鼓风干燥箱

       (2)试剂耗材

         T25细胞培养瓶

         血球计数板

         细胞培养孔板

         红细胞裂解液

         神经元完全培养基

         0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)

         多聚甲醛(PFA)

         DAPI

         Triton X-100

         山羊血清

         NSE

         Goat anti-Rabbit lgG(H+L)

         Cross-Adsorbed Secondary antibody,Alexa Fluor 594

         Fluoromount-G荧光封片剂

       2.分离培养方法

         1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡,

         2) 在冰浴的PBS中分离海马,PBS洗涤3次,剪碎,

         3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min,

         4) 用FBS终止消化,轻轻吹打,

         5) 过100 μm 滤网,

         6) 收集滤液,300 g离心5 min,

         7) 用完全培养基重悬沉淀,铺瓶。

        3.免疫荧光

        3.1.实验步骤 

      (1)细胞爬片

        取3片玻璃片于24孔板中,每孔加入培养基1mL,加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。

      (2)固定

        细胞爬片后,吸出培养基,用PBS洗1遍,加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可后一次不吸出PBS,放4℃过夜。

      (3)破膜封闭

        将玻片除去水分,置于培养皿支撑物上,

        玻璃片封闭液配置:0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合,再加10% 血清,

        取50uL破膜封闭液滴于防水膜上,将玻片上有细胞的一面盖上2h。

      (4)一抗孵育

        一抗配制:抗体与PBS 1:100(200)稀释

        破膜封闭后,取50uL一抗于防水膜上(湿盒中),将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃(多可放置一周)

      (5)二抗孵育

       室温避光孵育二抗(二抗:PBS=1:500)2h后,PBS洗3×5min/次,染DAPI(DAPI:PBS=1:1000)5min,PBS洗3×5min/次。

     (6)包埋

       玻片上各滴1滴Fluoromount-G,将有细胞的一面盖上。

       鉴定细胞为P1代细胞

       3.2.检测结果 

     (1)细胞免疫荧光鉴定照片

       阴性

                 

                           100X-DAPI                                             100X-Fluorescence

       NSE

     

                             100X-DAPI                                          100X-Fluorescence

       (2)检验基本情况:

        经免疫荧光鉴定,该细胞纯度达到90%以上。

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