小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法

海马体主要负责记忆和学习，日常生活中的短期记忆都储存在海马体中。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元具有长突起，由细胞体和细胞突起构成。

       小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织，因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性，具有不能传代，不能增殖等特点，所有收到细胞后尽快使用。

       1.试验所需仪器设备及试剂

       （1）仪器

        生物安全柜

        CO₂细胞培养箱

        荧光倒置显微镜

        高速冷冻离心机

        电热恒温鼓风干燥箱

       （2）试剂耗材

         T25细胞培养瓶

         血球计数板

         细胞培养孔板

         红细胞裂解液

         神经元*培养基

         0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）

         多聚甲醛（PFA）

         DAPI

         Triton X-100

         山羊血清

         NSE

         Goat anti-Rabbit lgG（H+L）

         Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 594

         Fluoromount-G荧光封片剂

       2.分离培养方法

         1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，

         2) 在冰浴的PBS中分离海马，PBS洗涤3次，剪碎，

         3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min，

         4) 用FBS终止消化，轻轻吹打，

         5) 过100 μm 滤网，

         6) 收集滤液，300 g离心5 min，

         7) 用*培养基重悬沉淀，铺瓶。

        3.免疫荧光

        3.1.实验步骤 

      （1）细胞爬片

        取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。

      （2）固定

        细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可后一次不吸出PBS，放4℃过夜。

      （3）破膜封闭

        将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，

        玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，

        取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。

      （4）一抗孵育

        一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释

        破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（多可放置一周）

      （5）二抗孵育

       室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。

     （6）包埋

       玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。

       鉴定细胞为P1代细胞

       3.2.检测结果 

     （1）细胞免疫荧光鉴定照片

       阴性

                           100X-DAPI                                             100X-Fluorescence

       NSE

                             100X-DAPI                                          100X-Fluorescence

       （2）检验基本情况：

        经免疫荧光鉴定，该细胞纯度达到90%以上。