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筛选稳定细胞株的两种方法

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  稳转细胞系(稳定表达细胞株)指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上,使细胞长期稳定表达该基因。稳转细胞株包括多克隆稳转细胞株和单克隆稳转细胞株。慢病毒感染目的细胞后,通过抗性基因筛选得到的细胞株是多个细胞克隆的组合。单克隆细胞株是从多克隆细胞中经细胞克隆挑选得到的,由一个细胞扩增得到的细胞株。单克隆细胞株性状统一,传代过程中细胞的基因表达保持稳定。
 
  

稳定细胞株
 

 

  筛选稳定细胞株的两种方法:
  
  1、转染质粒后,单克隆方法筛选稳定细胞系
  
  对大多数细胞转染效率较低。对于基因过表达,如果转染效率达到40%,基因过表达尚可。但是对于基因干扰实验,对转染效率要求远远高于基因过表达,通常质粒转染无法满足。
  
  另外,质粒游离于细胞质中,很快降解,无法满足较长时间的检测项目;质粒转染整合几率极低,稳定细胞株构建耗时耗力,且得率很低,往往需要挑取单克隆株。
  
  2、病毒感染筛选稳定细胞株
  
  病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效,是目前主流的稳定细胞系筛选方法。用慢病毒制备稳转细胞株,由于其高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广,感染效率高,且与细胞染色体整合而不发生基因重排,是制备稳定细胞株的理想载体。
  
  稳定转染细胞株服务流程:
  
  1、载体构建:将外源基因构建到合适的载体上,如需病毒转染,则包装病毒。
  
  2、筛选浓度测定:以10-14天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度。
  
  3、细胞接种:转染实验前天接种细胞,各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。
  
  4、细胞转染:用构建好的载体(或包装好的病毒)转染目的细胞。
  
  5、抗生素筛选。
  
  6、鉴定筛选结果。

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