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技术文章

猪骨骼肌卫星细胞永生化分离培养及鉴定、转染方法

更新更新时间:2024-05-15 浏览次数:58

骨骼肌细胞是人和动物体内最大的细胞之一,它们是由成肌细胞(Myoblasts)融合而来的多核细胞,故骨骼肌的形成是一个非常复杂的过程,并需要多种细胞信号通路的参与,包括phosphatidylinositol 3-kinase,calcineurin,STAT3和MAPK等。原代骨骼肌细胞的培养是研究细胞分化过程的有效的模型。

该细胞通过慢病毒转染的方式携带SV40基因。

细胞来源于正常动物肌肉组织,通过肌动蛋白(α-actin)免疫荧光染色鉴定为阳性,细胞纯度高于90%。细胞形态位梭形,不规则细胞,贴壁培养。

1.试验所需仪器设备及试剂

(1)仪器

仪器名称

规格型号

厂家

生物安全柜

BSC-1500ⅡA2-X

济南鑫贝西生物技术有限公司

CO2细胞培养箱

BC-J160S

上海博迅实业有限公司

荧光倒置显微镜

DS-Ri2

Nikon

高速冷冻离心机

Multifuge X1R

Thermo Fisher

电热恒温鼓风干燥箱

DHG-9123A

上海精宏实验设备有限公司

电热恒温震荡水槽

DK-2B

上海精宏实验设备有限公司

(2)试剂耗材

试剂名称

规格/货号

厂家

T25细胞培养瓶

430639

Corning

血球计数板

Neubauer improved

Marienfeld

24孔板专用细胞爬片

YA0350

Solarbio

细胞培养孔板

WHB-24

上海卧宏生物科技有限公司

胎牛血清

1414426

Gibco

骨骼肌卫星细胞专用培养基

Primed-iCell-018

赛百慷(上海)生物技术股份有限公司

0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)

1734858

Gibco

Collagenase Ⅰ

17018029

Gibco

Collagenase Ⅱ

17101015

Gibco

Collagenase Ⅳ

17104019

Gibco

多聚甲醛(PFA)

P1110

Solarbio

DAPI

C0060

Solarbio

Triton X-100

T8200

Solarbio

山羊血清

SL038

Solarbio

Myod

18943-1-AP

Proteintech

CoraLite594 – conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)

SA00013-4

Proteintech

Fluoromount-G荧光封片剂

0100-01

SourthernBiotech

2.猪骨骼肌卫星细胞的分离培养

1) 首先将猪颈部动脉放血致死。

2) 小心剪取后肢肌肉,剔除脂肪,筋膜,血管等,

3) 用PBS漂洗肌肉2-3次,

4) 将肌肉组织剪碎,

5) 加入3倍体积的0.1% Ⅰ+Ⅱ+Ⅳ型胶原酶4℃冰箱过夜消化,

6) 第二天,将混合液取出置于37℃水浴锅中震荡消化1h,

7) 过100目筛网,

8) 收集滤液,

9) 300g 离心5 min,

10) 重悬沉淀,铺瓶

细胞分离培养:

猪骨骼肌卫星细胞永生化分离培养及鉴定、转染方法

                                100x                                                     200x

原图见文件-细胞分离培养

3.免疫荧光鉴定

3.1实验步骤

(1)细胞爬片

取3片玻璃片于24孔板中,每孔加入培养基1mL,加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。

(2)固定

细胞爬片后,吸出培养基,用PBS洗1遍,加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS,放4℃过夜。

(3)破膜封闭

将玻片除去水分,置于培养皿支撑物上,

玻璃片封闭液配置:0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合,再加10% 血清,

取50uL破膜封闭液滴于防水膜上,将玻片上有细胞的一面盖上2h。

(4)一抗孵育

一抗配制:抗体与PBS 1:100(200)稀释

破膜封闭后,取50uL一抗于防水膜上(湿盒中),将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃(最多可放置一周)

(5)二抗孵育

室温避光孵育二抗(二抗:PBS=1:500)2h后,PBS洗3×5min/次,染DAPI(DAPI:PBS=1:1000)5min,PBS洗3×5min/次。

(6)包埋

玻片上各滴1滴Fluoromount-G,将有细胞的一面盖上。

鉴定细胞为P1代细胞

一抗为Myod

3.2免疫荧光鉴定结果

猪骨骼肌卫星细胞永生化分离培养及鉴定、转染方法

                        100X-DAPI                               100X-Fluorescence                

原图见文件-免疫荧光

4.转染

4.1SV40过表达慢病毒基本信息

实验信息表:

产品名称

SV40过表达慢病毒

载体信息

载体元件信息

EF1α-SV40-IRES-puromycin

携带荧光标记

GFP □   RFP□

抗性基因标记

Puromycin □  Blasticidin □

载体图谱

猪骨骼肌卫星细胞永生化分离培养及鉴定、转染方法

载体目的序列信息如下:

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黄色区域为目的序列区

4.2转染

(1)将细胞接种6孔板,每孔细胞数约为1×105 个,

(2)第二天,待细胞贴壁后,换液,

(3)加入1mLwan全培养基,再加20 μL SV40过表达慢病毒,

(4)混匀后继续培养,

(5)12h后观察细胞状态,并更换为新鲜培养基,

(6)当细胞长满板底后,传代至T25培养瓶中。

猪骨骼肌卫星细胞永生化分离培养及鉴定、转染方法

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原图见文件-转染

5.筛选

5.1杀灭曲线的确定

(1)将未转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板,孵育过夜,

(2)第二天,除去24孔板中旧的培养基,

(3)将含不同浓度嘌呤霉素(1μg/mL,2μg/mL,3μg/mL,4μg/mL,5μg/mL,6μg/mL,7μg/mL)的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板,

(4)每2天更换新鲜的筛选培养基,

(5)每天观察细胞的存活比例,

(6)最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的zui低筛选浓度。

结果:嘌呤霉素的使用浓度为2μg/mL,作用时间为2d。

5.2嘌呤霉素筛选转染细胞

(1)第一天,将转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板,孵育过夜

(2)第二天,除去24孔板中旧的培养基,

(3)加入含嘌呤霉素(2μg/mL)的筛选培养基,孵育,

(4)每2天更换新鲜的筛选培养基,

(5)每天观察细胞的存活比例,

(6)在同一时间点(2d)存活的细胞,即为转染成功的细胞,

(7)对筛选后的细胞进行扩增。

6.细胞扩增

将筛选后的细胞进行扩增,筛选后的细胞为P1代,扩增至少到12代。

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