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18621133861更新更新时间:2024-05-15 浏览次数:344
骨骼肌细胞是人和动物体内最大的细胞之一,它们是由成肌细胞(Myoblasts)融合而来的多核细胞,故骨骼肌的形成是一个非常复杂的过程,并需要多种细胞信号通路的参与,包括phosphatidylinositol 3-kinase,calcineurin,STAT3和MAPK等。原代骨骼肌细胞的培养是研究细胞分化过程的有效的模型。
该细胞通过慢病毒转染的方式携带SV40基因。
细胞来源于正常动物肌肉组织,通过肌动蛋白(α-actin)免疫荧光染色鉴定为阳性,细胞纯度高于90%。细胞形态位梭形,不规则细胞,贴壁培养。
1.试验所需仪器设备及试剂
(1)仪器
仪器名称 | 规格型号 | 厂家 |
生物安全柜 | BSC-1500ⅡA2-X | 济南鑫贝西生物技术有限公司 |
CO2细胞培养箱 | BC-J160S | 上海博迅实业有限公司 |
荧光倒置显微镜 | DS-Ri2 | Nikon |
高速冷冻离心机 | Multifuge X1R | Thermo Fisher |
电热恒温鼓风干燥箱 | DHG-9123A | 上海精宏实验设备有限公司 |
电热恒温震荡水槽 | DK-2B | 上海精宏实验设备有限公司 |
(2)试剂耗材
试剂名称 | 规格/货号 | 厂家 |
T25细胞培养瓶 | 430639 | Corning |
血球计数板 | Neubauer improved | Marienfeld |
24孔板专用细胞爬片 | YA0350 | Solarbio |
细胞培养孔板 | WHB-24 | 上海卧宏生物科技有限公司 |
胎牛血清 | 1414426 | Gibco |
骨骼肌卫星细胞专用培养基 | Primed-iCell-018 | 赛百慷(上海)生物技术股份有限公司 |
0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA) | 1734858 | Gibco |
Collagenase Ⅰ | 17018029 | Gibco |
Collagenase Ⅱ | 17101015 | Gibco |
Collagenase Ⅳ | 17104019 | Gibco |
多聚甲醛(PFA) | P1110 | Solarbio |
DAPI | C0060 | Solarbio |
Triton X-100 | T8200 | Solarbio |
山羊血清 | SL038 | Solarbio |
Myod | 18943-1-AP | Proteintech |
CoraLite594 – conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | SA00013-4 | Proteintech |
Fluoromount-G荧光封片剂 | 0100-01 | SourthernBiotech |
2.猪骨骼肌卫星细胞的分离培养
1) 首先将猪颈部动脉放血致死。
2) 小心剪取后肢肌肉,剔除脂肪,筋膜,血管等,
3) 用PBS漂洗肌肉2-3次,
4) 将肌肉组织剪碎,
5) 加入3倍体积的0.1% Ⅰ+Ⅱ+Ⅳ型胶原酶4℃冰箱过夜消化,
6) 第二天,将混合液取出置于37℃水浴锅中震荡消化1h,
7) 过100目筛网,
8) 收集滤液,
9) 300g 离心5 min,
10) 重悬沉淀,铺瓶
细胞分离培养:
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原图见文件-细胞分离培养
3.免疫荧光鉴定
3.1实验步骤
(1)细胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中,每孔加入培养基1mL,加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。
(2)固定
细胞爬片后,吸出培养基,用PBS洗1遍,加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS,放4℃过夜。
(3)破膜封闭
将玻片除去水分,置于培养皿支撑物上,
玻璃片封闭液配置:0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合,再加10% 血清,
取50uL破膜封闭液滴于防水膜上,将玻片上有细胞的一面盖上2h。
(4)一抗孵育
一抗配制:抗体与PBS 1:100(200)稀释
破膜封闭后,取50uL一抗于防水膜上(湿盒中),将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃(最多可放置一周)
(5)二抗孵育
室温避光孵育二抗(二抗:PBS=1:500)2h后,PBS洗3×5min/次,染DAPI(DAPI:PBS=1:1000)5min,PBS洗3×5min/次。
(6)包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G,将有细胞的一面盖上。
鉴定细胞为P1代细胞
一抗为Myod
3.2免疫荧光鉴定结果
100X-DAPI 100X-Fluorescence
原图见文件-免疫荧光
4.转染
4.1SV40过表达慢病毒基本信息
实验信息表: | ||||
产品名称 | SV40过表达慢病毒 | |||
载体信息 | 载体元件信息 | EF1α-SV40-IRES-puromycin | ||
携带荧光标记 | GFP □ RFP□ | 抗性基因标记 | Puromycin □ Blasticidin □ | |
载体图谱 |
| |||
载体目的序列信息如下: gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttcta ggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaat gaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatgg aactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaaca ttctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttg ctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacat actgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttg atgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaac aagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgttt aaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgcc aacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggat ataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaa aatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtgggggg aaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggagggga gtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaa agaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagatt atttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagttt gctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattg gagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcag ggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggtttt acttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaatctagacacagtgcagcactctcaacg ttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc 黄色区域为目的序列区 |
4.2转染
(1)将细胞接种6孔板,每孔细胞数约为1×105 个,
(2)第二天,待细胞贴壁后,换液,
(3)加入1mLwan全培养基,再加20 μL SV40过表达慢病毒,
(4)混匀后继续培养,
(5)12h后观察细胞状态,并更换为新鲜培养基,
(6)当细胞长满板底后,传代至T25培养瓶中。
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原图见文件-转染
5.筛选
5.1杀灭曲线的确定
(1)将未转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板,孵育过夜,
(2)第二天,除去24孔板中旧的培养基,
(3)将含不同浓度嘌呤霉素(1μg/mL,2μg/mL,3μg/mL,4μg/mL,5μg/mL,6μg/mL,7μg/mL)的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板,
(4)每2天更换新鲜的筛选培养基,
(5)每天观察细胞的存活比例,
(6)最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的zui低筛选浓度。
结果:嘌呤霉素的使用浓度为2μg/mL,作用时间为2d。
5.2嘌呤霉素筛选转染细胞
(1)第一天,将转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板,孵育过夜
(2)第二天,除去24孔板中旧的培养基,
(3)加入含嘌呤霉素(2μg/mL)的筛选培养基,孵育,
(4)每2天更换新鲜的筛选培养基,
(5)每天观察细胞的存活比例,
(6)在同一时间点(2d)存活的细胞,即为转染成功的细胞,
(7)对筛选后的细胞进行扩增。
6.细胞扩增
将筛选后的细胞进行扩增,筛选后的细胞为P1代,扩增至少到12代。
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