人脐静脉细胞HUVEC的实验步骤是怎样的？　

　　人脐静脉细胞HUVEC是从脐带组织中分离出来的；它是脐带的重要结构细胞之一，在人体的正常生理过程中发挥着重要作用。脐带是连接哺乳动物的胎儿和胎盘的管状结构。脐带中穿过尿道膜的血管是脐动脉和脐静脉，卵黄囊中的血管是脐肠系膜动脉和脐肠系膜静脉。在子宫内，来自胎盘母亲部分的子宫动脉的毛细血管与胎盘女儿部分的胎儿毛细血管接近，母亲和胎儿的血液在这里进行二氧化碳和氧气的交换，代谢物是代谢废物和营养物质。脐动脉将胎儿产生的废物输送到胎盘，而脐静脉将O2和营养物质从胎盘输送到胎儿体内。

 

　　人脐静脉细胞HUVEC是通过胰蛋白酶胶原酶联合消化法结合差异化粘附法制备的，并在内皮细胞专用培养基中进行了培养和筛选。细胞总数约为5×10^5个/瓶；细胞经CD31/vWF免疫荧光鉴定，纯度达90%以上，无HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。
 

       人脐静脉细胞HUVEC的实验步骤

　　1、将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌PBS溶液中保存。(注意：在4℃下最多可保存24小时，室温下可保存6小时，否则将被丢弃）。

　　2、将钝针插入脐静脉管，用无菌PBS液冲洗3-5次，直至污染的血液干净。

　　3、用手术钳夹住脐带下端，加入15ml胶原酶（1mg/ml）在室温下消化15-20分钟，并不时上下摇晃脐带。

　　4、消化结束后，松开下面的手术钳，将消化液流入50ml无菌离心管，用无菌PBS溶液冲洗脐带2-3次。

　　5、将收集的溶液离心（2000rpm）3分钟。

　　6、取出上清液，加入10mlM199培养基（加入10U/ml的bFGF），用肘部吹去细胞，将所有液体转移到用明胶包裹的培养瓶中，在37℃下培养（注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌1%明胶溶液，摇匀使明胶溶液*覆盖瓶底，37℃下培养至少2小时。使用前倒掉明胶溶液。明胶涂层有利于细胞壁的粘附）。

　　7、培养24小时后，倒出培养基，用无菌PBS溶液洗2-3次，洗去红细胞和死细胞，加入10ml新鲜M199培养基。

　　8、每2天更换一次培养基（每次更换2/3的培养基）。

　　9、一般来说，经过5-7天的培养，细胞可以生长到80-90%的单层，可以传代。

　　10、人脐静脉细胞HUVEC倒出培养基，用无菌PBS溶液洗2-3次，加入2-3毫升消化液（0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下观察。一旦细胞变圆，加入2-3次含血清的DMEM培养基以停止反应。

　　11、用肘部吹干细胞，将消化后的细胞转移到50ml无菌离心管中，2000rpm，离心3分钟。

　　12、倒出上清液，加入10毫升新鲜培养基。一般来说，3-4瓶细胞可以在一个瓶子里进行传代培养，然后像这样进行传代培养。

　　13、一般来说，通过2-3代（约20天）进行各种实验。