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产品名称:

H9 人胚胎干细胞(无饲养层)/STR鉴定

产品型号: H9
产品时间: 2020-01-06
描述:H9 人胚胎干细胞(无饲养层)/STR鉴定
H9 人胚胎干细胞特性
1) 来源:人胚胎干细胞
2) 形态:贴壁,呈克隆状
3) 含量:>1x106 个/mL
4) 污染:支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性
5) 规格:T25瓶或者1mL冻存管包装
6)用 mTeSR1 培养人胚胎干细胞(hESC)和人 iPS 细胞(hiPS)

产品介绍

H9 人胚胎干细胞/STR鉴定(无饲养层)特性

1) 来源:人胚胎干细胞

2) 形态:贴壁,呈克隆状

3) 含量:>1x106 个/mL
4) 污染:支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性
5) 规格:T25瓶或者1mL冻存管包装

运输和保存

可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式

(1)干冰运输,收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏;

(2)存活细胞,收到后应继续生长,传代达到细胞生长状态良好时,再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。

(3)收到细胞后请拍照,3天内如果发现污染,请及时拍照与我们联系。
 
细胞用途:仅供科研使用。
                       
细胞接收后的处理:
1) 收到细胞后,请检查是否漏液,如果漏液,请拍照片发给我们。
2) 请先在显微镜下确认细胞生长状态,酒精消毒瓶壁并将T25瓶置于37℃培养约2-3h。
3) 将T25瓶中的细胞培养基离心后,去上清,添加6ml完全培养基,加入新的T25瓶中继续培养。
4)   如果细胞长满80%请及时进行细胞传代.
 H9 人胚胎干细胞(无饲养层)/STR鉴定

用 mTeSR1 培养人胚胎干细胞(hESC)和人 iPS 细胞(hiPS)

1. 试剂和材料

mTeSRTM1 培养基试剂盒(产品号#85850)包括:

成分

规格

存放条件

mTeSRTM1

基础培养基(#85851)

400

mL

2-8

mTeSRTM1

5X 添加物(#85852)

100

mL

-20

所需的其他试剂和材料

产品

品牌/货号

Cryostor CS10

STEM CELL/07930

温和分离液

STEM CELL/07174

DPBS(不含钙镁离子)

GIBCO/14190

DMEM/F12

GIBCO/11330

Y27632

STEM CELL/ 72302

BD Matrigel hESC-qualified

Matrix

CORNING/354277(BD 该系列产品已被

CORNING 收购)

细胞刮

如,CORNING/3010

另需细胞培养板/瓶/皿,15ml 离心管和移液管等细胞培养耗材。

 

2. 试剂的制备

2.1 mTeSR1 的制备
2.1.1 在室温 (15 - 25°C) 下或冰箱内 (2 - 8°C) 过夜解冻 mTeSR
™1 5X 添加物(成分编号 #05852)。 如需要,可在无菌条件下将 5X 添加物分装为适量的工作等份,并在 -20°C 下冻存。冷冻的分量须在 3 个月内用完。解冻后的分量应在 1 天内制备成完全的 mTeSR™1 培养基。请勿在解冻后再次冷冻。
2.1.2 在无菌条件下将 100 mL 的 5X 添加物全部解冻后加入到 400 mL 的基础培养基中,形成总共 500 mL 的容量。充分混匀。完全的 mTeSR™1 培养基 在(2 - 8°C) 下储存时可维持稳定状态最多 2 周,或在-20°C 下冷冻时可维持稳定状态最多 6 个月。在室温(15 - 25°C) 下或冰箱内(2 - 8°C) 过夜解冻冷冻的培养基,不要长时间放在 37°C 水浴内加热培养液。
如果在无菌条件下制备,完全的 mTeSR™1 培养基可直接使用,但如需要, 也可使用 0.2 µm 的低蛋白结合过滤器过滤培养基。

2.2 Matrigel 工作液配制和包被

应分装和冷冻保存 BD Matrigel™ hESC-qualified matrix(BD 产品号
#354277)。有关分装的完整说明和建议,请查阅与 BD Matrigel™ 同时提供的产品说明书。分装后的小包装可在-70°C 下最多储存 6 个月。
将一份BD Matrigel™ 加入到25 mL 的DMEM/F12 中,这足以包被四个6 孔培养板(1 mL/孔)或三个 100 mm 培养皿(8 mL/培养皿)。
(1) 将 25 mL 的稀释培养基(DMEM/F12;产品号#11330 )分装入离心管放在冰上。
(2) 将一份分装后的 BD Matrigel™自-70°C 取出 ,在冰上解冻,直到成为液体,然后将解冻后的 BD Matrigel™ 加入到冷稀释培养基(在 50
mL 的试管中)中,充分混匀。如需要,可用冷培养基冲洗 EP 管。
(3) 立即用稀释后的 BD Matrigel™ 溶液包被组织培养板。对于 6 孔培养板,每个孔使用 1 mL 稀释后的 BD Matrigel™;对于 100 mm 培养板, 每个培养板使用 8 mL 稀释后的 BD Matrigel™。旋动培养板,以使 BD
Matrigel™ 溶液均匀地分布在表面上。
要包被其他尺寸的组织培养皿,则按照需要包被的培养皿的表面积决定稀释后的 BD Matrigel™用量。
(4) 使用前,包被的培养板应放在培养箱(37°C) 下至少 1 个小时。请勿让培养板脱水。在培养板可供使用之前,请勿移除 BD Matrigel™ 溶液。
如果不立即使用,培养板必须密封,以防止脱水(如利用 Parafilm®)。包被后的培养板可在 2 - 8°C 下最多储存 7 天。
如果 BD Matrigel™溶液并未完全覆盖表面,则无法实现zui佳的 hPSC 培养;因此,不建议使用含有溶液已蒸发区域的培养板。
(5) 轻轻地将培养板向一个角落倾斜,使过剩的 BD Matrigel ™ 溶液汇聚在那个角落。用一次性移液管或通过抽取移除溶液。确保移液枪头不刮到已包被的表面。立即加入 mTeSR™1 培养基和细胞。
如果已将培养板在 2 - 8°C 下储存,则在移除 BD Matrigel™溶液之前, 将培养板在培养箱 (37°C) 下放置 30 分钟。

2.3 配制 Y27632 溶液

Y27632 粉末溶解在 DPBS 中,配成浓度为 10mM 的储存液,0.22um 滤膜过滤除菌。分装后冷冻于-20°C,6 个月内使用。
Y27632 提高复苏和传代后的克隆形成率,所以只在复苏步骤和传代步骤添加,换液时不添加 。
 

3. 解冻复苏 hES /hiPS

在开始操作程序之前,将所有试管、加热后的培养基和培养板准备好,以确保尽快完成解冻程序。
(1) 快速在 37°C 水浴槽中解冻 hPSC,方法是轻柔持续地摇动冷冻管,直到

只剩下一个小冷冻团。从水浴槽中取出冷冻管,用 70% 乙醇擦拭,以进行消毒。
(2) 使用一个 1 mL 的移液管将冷冻管中的内容物转移至一个 15 mL 锥形试管中, 过程必须轻柔防止吹散细胞团。
(3) 将 5 - 7 mL 温暖的 mTeSR™1 逐滴加入试管中,在加入培养基的同时轻柔混匀。
(4) 在室温(15 - 25°C) 下,以 300 x g 离心细胞 5 分钟。
(5) 吸出培养基,使细胞团保持完整。使用一个 1 mL 的移液管,轻轻地将细胞重新悬浮在 1 - 2 mL 的 mTeSR™1 中,确保维持细胞的团块状态。根据最终培养细胞的液体体积,加入 ROCK inhibitor Y27632, 终浓度为 10uM
(6) 轻轻地将培养板/皿向一个角落倾斜,使过剩的 BD Matrigel™ 溶液汇聚在那个角落,从而从已包被的组织培养板中移除 BD Matrigel™。使用一次性移液管或通过抽取移除溶液。确保移液枪头不刮到已包被的表面。
如果已将培养板在 2 - 8°C 下储存,则在移除 BD Matrigel™溶液之前,将培养板在培养箱 (37°C) 下 放置 30 分钟。
(7) 将含有细胞聚集体的培养基转移至 BD Matrigel™ 包被的培养器皿上。一般一支冻存管细胞复苏到一个 T25 培养瓶或 6 孔板中的 2 个孔。
(8) 将培养板放在 37°C 培养箱中,然后快速地左右、前后移动培养板,以均匀地将细胞团分布在各个孔内。在 37°C、5% CO2 和 95% 湿度的条件下培养细胞。
(9) 每天更换培养基(不需要再添加 Y27632)。在解冻后大约 5 - 7 天内检查可进行传代的未分化集落(有密集的中心)。
如果在解冻后仅观察到很少的未分化集落,则可能需要只选择这些集落进行传代,并将它们重新放在新的 BD Matrigel™包被的培养板大小相同的孔中。
(10) 每天换液。
 

4. 用 mTeSR1 对 hES/hiPS 进行传代

在 mTeSR™1 中生长的细胞当集落变得较大、中心变得密集和明亮(对比其边缘)而相邻的集落开始融合时,这时可进行传代。根据接种的细胞团的大小和密度,传代周期为 5 天左右。如果太早对集落进行传代或传代太过频繁,则细胞可能吸附不好、产量将会减少且细
胞可能分化。如果太晚对集落进行传代,培养物将开始显示分化迹象(特点是细胞类型出现不同的形态)。
(1) 分装足够的 mTeSR™1 以传代细胞。将分装的 mTeSR™1、温和分离液(产品号#07174)和 DMEM/F-12 加热至室温( 25°C 左右)。
(2) 使用显微镜观察确定分化的区域。用毡制粗头笔或透镜标志器在培养板底部标记这些区域。如果培养物品质优异,分化的区域不会超过培养孔的 20%。
(3) 用移液枪头刮除或抽取,去除分化区域。
(4) 从 hPSC 培养物中吸出培养基,然后用 DPBS(不含钙镁离子)冲洗。
(5) 向每个培养瓶内加入温和分离液(每个 T25 加 3ml),覆盖底面,在室温下静置 1 分钟。

(6) 吸掉温和分离液,然后用 6ml DMEM/F-12 轻轻的洗涤培养皿一次。
(7) 向培养瓶内加适量 mTeSR™1,并用细胞刮(如 Corning 产品号#3010)将细胞集落刮离培养瓶底。
(8) 将分离的细胞聚集体转移至一个 15 mL 锥形试管中,并加入适量 mTeSR
™1 冲洗培养瓶,以收集残留的细胞聚集体。将冲洗液一并收集到 15 mL 离心管内。
轻轻吹打细胞聚集体 2-3 次,调整培养基的体积,以实现适当的分配。根据最终培养细胞的液体体积,加入 ROCK inhibitor Y27632, 终浓度为 10uM。
(9) 将细胞聚集体与 mTeSR™1 接种至新的 BD Matrigel™ 包被的培养板上。一般传代周期为 5 天左右,传代比例为 1:3-1:6。如果集落过于密集或过于稀疏,则下一次传代时相应地调整传代比例。请注意,这些指导基于中科院干细胞库 hESC H1 和 H9 以及 hiPS DYR0100 和 DYP0530 细胞系的生长特征,在其他不同的细胞系和实验室之间可能会存在差异。
(10) 快速前后和左右多次移动培养板,以使细胞分散在各个孔的表面。将培养板放在 37°C 培养箱中。确保新接种的集落均匀地分布在 BD Matrigel
™包被的培养板的整个表面。细胞团分布不均匀有可能导致 细胞分化。
(11) 每天换液。

5. 冷冻 hESC 或 hiPS 细胞

(1) 用显微镜观察需要冻存的培养物,确定已分化的区域。用毡制粗头笔或透镜标志器在培养板底部标记这些区域。
如果培养物品质优异,分化的区域不会超过培养孔的 20%。
(2) 用移液枪头刮除或抽取,去除分化区域。
(3) 从培养孔中吸出残留的培养基,然后用 DPBS(不含钙镁离子)冲洗。
(4) 向每个培养瓶内加入温和分离液(每个 T25 加 3ml),覆盖底面,在室温下静置 1 分钟。
(5) 吸掉温和分离液,然后用 6ml DMEM/F-12 轻轻的洗涤培养皿一次。
(6) 向培养瓶内每个孔内加适量 mTeSR™1,并用细胞刮(如 Corning 产品号
#3010)将细胞集落刮离培养瓶底。
(7) 将分离的细胞聚集体转移至一个 15 mL 锥形试管中,并加入适量 mTeSR™1 冲洗培养瓶,以收集残留的细胞聚集体。将冲洗液一并收集到 15 mL 离心管内。小心地尽量将细胞团保持到最大。
(8) 在室温(15- 25°C) 下,以 300 x g 离心装有细胞聚集体的 15 mL 离心管
5 分钟。离心细胞时,准备和标记冻存管。
(9) 轻轻地吸出上清液,小心保持细胞团完整。
(10) 使用预冷的(2 -8°C) CryoStor™CS10 轻轻地重新悬浮细胞团,然后将细胞悬液转移至冷冻管中。
(11) 将冷冻管置于程序降温盒内(大约-1°C /min)-80°C 冷冻细胞过夜, 然后转移至液氮长期储存。

赛百慷(上海)生物技术股份有限公司主要产品和技术服务:

一、原代细胞服务
       各类模式哺乳动物的多种原代细胞资源;
       多种人源性正常及肿瘤原代细胞资源;
       原代细胞分离和培养相关试剂、kit、培养基添加剂等;
       原代细胞相关技术服务和整体实验外包服务;

二、细胞株/系服务
       细胞株/系培养、增殖、冻存和相关说明书;
       细胞系培养过程的技术指导;
       细胞系培养基、添加剂、血清及相关生长因子、试剂等;

三、iPS细胞
       iPS细胞基础培养(有滋养层or无滋养层在);
       iPS细胞增殖及冷冻保存;
       iPS基础培养技术实习;
       新药及实验仪器上市前评估;

四、技术外包服务:各类细胞生物学实验、分子生物学实验、显微镜拍照服务等

五、其他:根据客户需要定制服务等

序号

产品名称

货号

规格

售价

备注

1

培养基1640

icell-0002

500ml

140

 

2

培养基DMEM

icell-0001

500ml

140

 

3

培养基DMEM/F12

icell-0005

500ml

140

 

4

内皮细胞培养基ECMsciencel

icell-0016

500ml

2280

 

5

动物上皮细胞培养基Epicm-a

icell-0015

500ml

1980

 

6

上皮细胞培养基Epicm

icell-0017

500ml

1980

 

7

Mccoy’s 5A 培养基

icell-0011

500ml

160

 

8

MEM培养基

icell-0012

500ml

140

 

9

FBS北美胎牛血清

GIBCO   16000-044

500ml

6800

 

10

FBS墨西哥胎牛血清

10437-028

500ml

5616

 

11

马血清

gibco.16050122

500ml

1489

 

12

DMSO

sigma-D2650

100ml

1520

 

13

PBS片剂(1000ml)

09-9400-100

100片

4170

 

14

PS双抗(进口)

15140-122

100ml

452

 

15

胰蛋白酶

25200-072

500ml

665

 

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